【干货】手把手教你快速做出高质量的标准曲线

标准品的制备

标准品可以是包含目的片段的PCR产物，可以是包含目的片段的质粒，或体外转录的RNA。标准品提供一个浓度标准，如果产生降解，也就不能被用做标准了。质粒是最稳定也是最常用的标准品。

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质粒标准品制作流程

Step1. 以DNA/cDNA为模板，利用定量引物扩增目的片段。

Step2. 目的片段连接到线性化质粒载体上。

Step3. 阳性斑筛选，测序鉴定后，完成质粒标准品构建。

Step4. 利用紫外分光光度计测定质粒浓度，根据质粒大小即可换算出其浓度或者拷贝数。

Step5. 原浓度标准品以10为倍数按照下图方式进行倍比稀释，得到6个不同浓度的标准品。

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标准品模板拷贝数计算方法

以双链DNA为例：

1 OD260 = 50 ng/μl 双链DNA

待测样本浓度(ng/μl) = OD260×50 (×稀释倍数)

脱氧核苷酸平均分子量=324.5

1 μl双链DNA标准品物质的量(mol) = (稀释倍数×OD数×50×10-9)/(序列长度×649)

1 μl双链DNA标准品的数量(copies) = (稀释倍数×OD数×3×1016)/(序列长度×649)

标准曲线的制作

以不同浓度的标准品为模板，每一个标准品至少3个技术重复，同时做qPCR扩增，如果在荧光定量仪器上提前设置好标准品的不同浓度，那么反应结束后，仪器会自动生成标准曲线，当然我们也可以用EXCEL软件来生成标准曲线。

上图是我们得到的一个标准曲线的案例，横坐标是模板浓度的lg值，纵坐标是Ct值，公式y=-3.2825x+31.906代表两个变量之间的线性关系，也就是所测反应体系及引物的标准曲线。我们主要通过以下三个要素来评判标准曲线的质量高低。

1. R2：称为决定系数，要求大于0.98，值越高，代表标准曲线的线性化程度越好。

2. 扩增效率En: 要求扩增效率在90%-110%范围内，后续定量结果才更准确，扩增效率En=10-1/斜率 - 1，由公式推算出满足条件的斜率范围是-3.58至-3.1之间。

3. 线性范围：指的是Ct值和模板浓度的lg值之间呈线性关系时模板浓度范围，过低的模板浓度（试剂灵敏度不高）或者过高的模板浓度（含有抑制剂影响）可能不呈线性关系，如果样本浓度超过线性范围，定量不准确。因此，线性范围越宽广，能够准确测量样本浓度的范围也越宽广。